课题分享 | Synplode: An Innovative Approach to Landmine and UXO Clearance

1. 课题基本信息

课题名称：Synplode: An Innovative Approach to Landmine and UXO Clearance

主要内容：课题关注能够检测和分解 TNT 和 RDX（在老化的地雷和 UXO 中最常见的两种炸药）的细菌，提供了一种可扩展、成本效益高且风险低的 UXO 清除方法。

Wiki 网址：https://2024.igem.wiki/epfl/

阅读目标：了解课题背景、课题原理、生物安全。

2. 课题背景

冲突过去几十年后，地雷外壳的缓慢降解并没有消除危险，反而由于三硝基甲苯（TNT）和环三亚甲基三硝胺（RDX）等有毒爆炸化学物质的泄漏，导致土壤和水污染；因为第二次世界大战后，数千吨弹药被挖掘或沉入湖泊；未爆炸弹药对我们社会的社会、经济和环境生活造成了可怕的后果。

土地行动的步骤：初步筛查→非技术性调查→技术性调查→清除地雷。

目前排雷情况表明，最大的开支与清障和技术性调查相关。目标是最大限度地减少这些昂贵的操作，从而实现更广泛且财务可持续的区域清障。

该项目致力于通过开发创新解决方案来应对这一持续存在的威胁，旨在通过开发爆炸降解细菌和实施先进的无人机技术来提高地雷解除过程，以实现高效的地雷探测。通过这些举措，力求使地雷清除更加安全、经济、快速，最终减轻全球战争遗留的致命遗骸的负担。

3. 课题原理

团队需要设计出一种专门细菌，能够检测和降解 TNT 和 RDX。

1. 检测

检测的细菌通过无人机以可控的方式释放，随着细菌沉降到土壤中，它们开始对 TNT 和 RDX 发光，揭示地表下的潜在危险。

2. 识别

一旦发现爆炸物，就会部署第二架无人机对该区域进行扫描。这架无人机配备了先进的成像技术和检测软件，旨在识别并绘制由细菌产生的发光点的精确位置。该软件可安装在任何标准 PC 上，无需互联网连接即可运行，实时处理数据，生成受污染区域的准确地图。这一识别过程对于后续排雷行动中针对特定地点至关重要，确保资源得到有效分配。

3. 降解

引入能够降解 TNT 和 RDX 的工程菌，这些菌被用于已识别的区域。这些细菌产生特定的酶，如 nfsA、nfsB 和 XplA，将爆炸物分解成非爆炸性化合物，如亚硝酸盐和甲醛。整个过程受到严密监控，内置的关闭开关确保细菌仅在 TNT 或 RDX 存在时保持活性，防止任何意外环境影响。

(1)TNT 降解

① 降解：

在E. coli K12 中，酶 NemA、NfsA 和 NfsB 可还原 TNT 芳香环上的多达两个硝基，将它们转化为羟基氨基衍生物；且过表达 NemA 的大肠杆菌细胞降解 TNT 的速度比野生型菌株快三倍。

故，在 E. Coli 中过表达 NemA、NfsA 和 NfsB 酶，以将 TNT 降解为非爆炸性化合物，如 2,4-二氨基-6-硝基甲苯（TAT），同时通过释放铵离子促进 E. Coli 生长。

② 感应：

为了在细菌接触 TNT 时诱导基因表达，使用响应 TNT、DNT 以及降解产物二羟基甲苯（THT）的 yqjF 启动子；该启动子被其他团队改造，为yqjF3rd。沿着他们的思路，采用他们设计的 yhaJ 转录激活因子版本，即 yhaJ1st，以提高启动子的敏感性。

③ 指示：

将 Electra2 蓝色荧光蛋白置于这些酶的下游，作为启动子活性的报告者和最终应用中 TNT 检测的传感器，使细菌发出蓝色荧光。

图1. TNT 降解和检测构建体

(1)RDX 降解

① 降解：

XplA 和 XplB 酶催化 RDX 的降解。

图2. RDX 降解

② 检测：

使用一种 RDX 敏感的核糖开关，该开关在翻译水平上起作用，在 RDX 结合时选择性诱导 XplA 和 XplB 的翻译。将 XplA 和 XplB 序列置于 RDX 核糖开关下游，以便在 RDX 结合时进行受控翻译。操纵子的转录是组成性的，由 J23100 启动子驱动。使基因的转录保持恒定。这种设计确保了细菌一旦遇到 RDX 就能迅速产生酶。

③ 指示：

使用荧光蛋白 mNeonGreen 作为核糖开关活性的报告者和 RDX 存在的传感器，这使得细菌在 RDX 存在时发光呈绿色。

图3. RDX 降解和检测构建体

4. 验证

一旦降解过程完成，系统会检查 TNT 和 RDX 的缺失以及无害副产物如甲醛的存在。细菌中工程化的第二种荧光标记在所有爆炸物被成功中和时发出红色光芒。这种红色光芒作为清晰且明确的信号，表明该区域再次对人类活动安全。然后使用相同的无人机技术验证结果，提供全面可靠的确认，表明排雷过程已成功。

● AND 逻辑门

只有在两种化合物（TNT 和 RDX）都缺失且降解产物存在时才会激活，确保红色标记是任务完成的指标。

图4. 当化合物被降解时，细菌发光呈红色

当 TNT 存在时，yqjF3rd 被激活，并产生抑制 pBad 的 araC；RDX 存在导致 tetR 的表达和 pTet 启动子的抑制；frmR 抑制 frm 启动子，在甲醛存在时失活。

图5. 逻辑门原理

图6. 逻辑门应用原理

4. 生物安全

（一）自杀开关

1. 自杀开关——CcdA/CcdB 系统

细胞的存活和生长依赖于抗毒素 CcdA 的条件性产生，以对抗 CcdB 毒素的表达。

● CcdA/CcdB 型 II 类毒素-抗毒素系统基于两种蛋白质 CcdA 和 CcdB 之间的相互作用。CcdB 是来自大肠杆菌的毒素，靶向 DNA 解旋酶（II 型拓扑异构酶）的亚基，导致 DNA 双链断裂和细胞死亡。抗毒素 CcdA 与 CcdB 结合，抑制其活性，防止毒素效应。该系统通过平衡毒素和抗毒素水平来调节细胞存活。

使 CcdB 在组成型启动子的控制下表达，确保其持续产生，同时将 CcdA 的产生与 TNT 激活的 yqjF3rd 启动子和 RDX 依赖的核糖开关相耦合，确保抗毒素仅在存在目标化合物（TNT 或 RDX）的情况下产生，使生物体能够在触发自我毁灭之前，在降解过程完成后存活并执行其任务。

图7. 自杀开关：依赖 TNT/RDX 生存

2. 自杀开关——CcdA/CcdB 系统

使用这个系统，需要在 TNT 和 RDX 的存在下培养细菌，以便它们能够存活，但希望这种依赖性只在雷区或其他污染区域部署时被激活，故，设计一个 Lox FLEx（翻转-切除）开关，用于 CcdB 的条件基因表达。

通过在 CcdB 基因相对于其启动子的反义方向克隆该基因，并在其周围放置 loxP 和 lox2272 识别位点来实现的，通过表达通过茶碱核糖开关的 Cre 重组酶蛋白，可以条件性地诱导 CcdB 的产生。一旦产生，Cre 能够切除并反转其目标序列，从而引发 CcdB 的产生。

图8. 茶碱依赖性激活的“自杀开关”

（二）营养依赖

避免水平基因转移（HGT）： Dut/Ung 突变体。

抗生素耐药基因（ARGs）的潜在转移是处理转基因细菌时的一大担忧。ARGs 导致多重耐药性，威胁人类和动物健康。在我们的项目中，我们的细菌与原生土壤细菌之间发生水平基因转移（HGT）的可能性可能导致 ARGs 的传播，尤其是我们的质粒含有氨苄西林和卡那霉素的耐药基因。虽然这些基因在环境中不提供选择性优势，但抗生素耐药性的发展仍然是我们旨在通过高级安全机制防止的关键问题。

借鉴了 2023 年 EPFL iGEM 团队的工作：Dut/Ung 系统。是一种利用两个关键基因 DUT 和 UNG 的突变来减轻水平基因转移（HGT）风险的方法。在细菌中，DUT 负责减少尿嘧啶掺入 DNA，而 UNG 则从 DNA 链中去除尿嘧啶残基。这种组合确保通过 HGT 交换的任何遗传物质将是不稳定的，且不太可能持续存在，从而防止潜在有害特性（如抗生素耐药性）的传播。

5. 个人总结

在自杀开关设计上的亮点是激活“自杀开关”（翻转剪切启动自杀开关）并将生物安全与课题设计相结合（茶碱依赖性激活）。关于耐药性、水平基因转移方面，提出突变两个关键基因 Dut/Ung 来防止 HGT。