IGEM文献分享 | 无细胞系统：一种用于代谢工程快速原型制作的合成生物学工具

1. 论文基本信息

论文名称：

Cell-free systems: A synthetic biology tool for rapid prototyping in metabolic engineering,

作者：

Kumyoung Jeung, Minsun Kim, Eunsoo Jang, Yang Jun Shon, Gyoo Yeol Jung

期刊：

Biotechnology Advances

发表日期：

2022年

2. 背景知识与课题联系

由于酶检测体系中含有大量较高毒性的壳寡糖，菌株难以在该条件下存活，因此需要开发更好的检测方法。在之前的探索中，使用谷胱甘肽、加强氨基葡萄糖的表达等增强菌株抗逆性的方案在以往的经验中反而会增大菌株的代谢压力。因此，需要寻找到没有菌株存活率干扰的方案来替代原有检测菌系统。无细胞系统（CFSs）能利用细胞成分在体外进行生化反应，可实时调控反应条件，为代谢工程研究提供了新途径。这篇全面综述了 CFSs 在代谢工程快速原型设计中的应用，阐述其优势、研究实例及面临的挑战。

注：这篇文献发表时间靠近，同时参考其他大刊的相关文献

3. 研究结果

无细胞系统在遗传电路原型设计中的应用

针对非模式生物遗传工具开发困难的问题，CFSs 可快速对基因调控元件（如启动子、核糖体结合位点）进行原型设计。以假单胞菌、芽孢杆菌等多种非模式生物为例，优化的 CFSs 可评估翻译和转录效率，进而调控代谢通量。在遗传编码装置原型设计方面，CFSs 能高效评估 CRISPR 系统中 gRNA 活性、PAM 偏好性等，还可对生物传感器进行精细调节，如调整 TF - 基于生物传感器的模块比例，筛选出更优的生物传感器，但体外原型生物传感器在应用前需在细胞系统中进一步验证

无细胞系统在生物合成生产原型设计中的应用

微生物生产目标化合物面临细胞毒性和代谢途径复杂等问题。CFSs 在细胞毒性生物合成途径原型设计中优势明显，如在苯乙烯、丙酮和聚羟基脂肪酸酯（PHA）的生产中，可绕过繁琐的文库构建，优化反应条件和酶比例，提高产物产量。对于复杂多步生物合成途径，CFSs 可确定最佳酶比例和反应条件，提高产物产量，还能用于新型途径的原型设计，如评估从乙醇生产高价值 C4 醇的新途径和设计新的药物合成途径。在抗菌肽（AMP）开发方面，CFSs 为其合成和筛选提供了可控环境，结合深度学习可加速新型 AMP 的发现

无细胞系统在酶功能原型设计中的应用

传统基于细胞的定向进化存在局限，CFSs 结合区室化策略可有效解决。通过创建微区室，如脂质体、乳液滴等，可实现大规模酶突变体库的筛选。在膜蛋白工程中，脂质体模拟天然细胞膜环境，有助于膜蛋白的功能表达和筛选，如对 ATP 合酶、EmrE 等膜蛋白的研究。同时，也面临一些挑战，如区室材料对酶稳定性和荧光信号的影响，目前已有相应的解决策略，如使用特定材料调节内部环境、固定化酶等

图 1 代谢工程的生物靶点及细胞和无细胞系统作为原型平台

该图展示了细胞系统和无细胞系统在代谢工程中的不同作用。在细胞系统中，通过转化或基因组编辑将 DNA 导入宿主细胞，经培养生产目标产物；无细胞系统则是将细胞提取物与模板 DNA 等混合，在体外快速创建和测试原型。此图清晰呈现了两种系统的工作流程差异，突出无细胞系统在原型设计上的便捷性，为后续理解其在各方面的应用奠定基础。

图 2 细胞和无细胞系统中遗传部件和电路原型设计概述

对比了细胞和无细胞系统在遗传部件和电路原型设计过程的差异。从构建环节看，细胞系统需将亚克隆质粒 DNA 转化到宿主细胞，而无细胞系统仅需准备线性或质粒 DNA 及细胞提取物；测试环节，细胞系统需培养细胞后取样分析，无细胞系统则是混合反应成分后在 96 孔板中进行原位蛋白质合成及分析。无细胞系统在时间上具有显著优势，从图中估算可知，细胞系统需数周，无细胞系统仅需几天，直观体现了其加速原型设计的能力。

图 3 细胞内代谢途径示意图及无细胞系统中生物合成生产的原型设计

图 3A 展示了细胞内生物合成生产途径面临的挑战，如代谢物的细胞毒性和代谢途径的复杂性；图 3B 呈现了利用无细胞系统优化生物合成生产途径的过程，包括调节反应条件、测试多种酶的表达水平组合以优化最终产物浓度。通过对比，突出无细胞系统能规避细胞内复杂问题，为优化生物合成途径提供更简单有效的平台。

图 4 细胞和无细胞系统中酶功能原型设计示意图及无细胞系统中原型设计的示例

图 4A 对比了细胞和无细胞系统在酶功能原型设计过程，细胞系统受转化效率和酶特异性选择系统限制，无细胞系统结合区室化策略可处理更大规模的酶突变体库；图 4B 和图 4C 展示了在脂质体中筛选转运蛋白 EmrE 和分析F0F1-ATP 合酶活性的示例，体现了无细胞系统在膜蛋白工程方面的独特优势，为研究膜蛋白功能提供了新方法。

4. 总结与启发

CFSs 能精确重构转录和翻译反应系统，极大缩短实验时间和工作量，避免细胞系统中的诸多问题，在遗传元件、酶和代谢途径等方面的原型设计中成果显著。然而，它也存在一些局限性，如对氧敏感的蛋白质和辅因子在有氧条件下易失活，细胞提取物制备过程复杂且敏感，反应混合物的转录翻译能力有限导致资源竞争等。

无细胞系统可以尽可能减少外界环境对于工程菌的影响，与前置的相分离实验相契合，因此是值得深入研究的方案。

文中没有给出相关的配方，需要进一步查找相关资料进行探索。

文中给出了一些更加新颖的设计思路，包括但不限于囊泡表达、与CRISPR系统联用等等，可以作为本课题的进阶思路参考。