课题：Aqualose: Customisable Ultrafiltration Membranes from Bacterial Cellulose —— 2014 Imperial College London
主要内容：利用木醋杆菌的基因修饰大肠杆菌，使大肠杆菌具有生产 BC 的能力。
Wiki网址：https://2014.igem.org/Team:Imperial
关键词：BC、acsABCD、E. coli、Gluconacetobacter Xylinus
本次阅读目标：了解如何修饰 E. coli，使其能具有更好的BC生产效率。同时思考利用野生木醋杆菌作为工程菌的可能性。
引言
Introduction
此课题生产的产物与我们相同，也是细菌纤维素。同时，也同我们一样，利用了木糖醋杆菌（简称木醋杆菌）的基因去修饰大肠杆菌。由于考虑到我们目前设计可能存在细菌纤维素（以下简称 BC）产率不足的问题，因此想从本篇课题中寻找其他提高产量的方法。
大肠杆菌是合成生物学的首选生物体。它具有全面的特性，易于设计。一些大肠杆菌菌株已进化为产生少量纤维素，但其机制受到特定调控系统控制（其分泌通常与生物膜形成和应激情况有关）。考虑到细菌纤维素的利用价值，以及大肠杆菌在生长上的优势，课题组尝试将拥有高 BC 产量的木醋杆菌的系统，转移到大肠杆菌中，并使其发挥作用。
经过研究与学习，课题组确认木糖醋杆菌的高产纤维素生产机制可以转移到其他生物体中。最后，使用了刚果红结合测定，证明了大肠杆菌中产生 Acs 纤维素的操纵子的功能。简单来说，本课题中，成功在大肠杆菌中组装了一个全合成的、功能性的纤维素生产系统。
设计
Design
该课题组的设计理念为：将木醋杆菌中的 Acs 操纵子移植到大肠杆菌中。具体实现方法为，将 acs A 和 acs B 连接在一个骨架上，而 acs C 与 acs D 连接在一个骨架上，相当于是把操纵子拆成两个部分，并且可以分开诱导表达。
a. Acs 操纵子
Acs 操纵子是木糖醋杆菌中的纤维素生产操纵子是一个 10kb 的基因组区域，由四个主要元件组成：acs A、acs B、acs C、acs D。
i. acs AB 被称为纤维素合成酶，由两个结构域组成：acs A 是催化结构域，acs B 是环二鸟苷酸（c-di-GMP）结合结构域。这种模块化的酶需要第二信使环二鸟苷酸，以进行有效的催化。
ii. acs C 编码一个低聚物元素，它被嵌入细胞外膜，并允许生长的聚合物穿过细胞膜运输到细胞外环境
iii. acs D 被认为是一个非必需的元素，尽管在控制纤维素结晶度起关键作用，并且是维持纤维素最大生产力所需要的部件。
Acs AB 嵌入细胞质膜中，并在附着细胞质中的葡萄糖单体时将生长的聚合物输送通过膜。在缺乏 Acs C 和 Acs D 的情况下，纤维素无法分泌到环境中，则纤维素应该会积聚在细胞的周质中。
b. 分子克隆部分
i. 准备工作
课题组首先在 NCBI 中查找出 acs ABCD 四个部件的基因序列，并进行一些大肠杆菌优化，去除一些天然调节。这是由于天然操纵子在转录、翻译和翻译后水平上受到高度调控。同时，经过模拟计算后，发现该启动子区域自带的核糖体结合位点（ribosome binding site, RBS）较弱。因此后续也用强 RBS —— B0034 替代。
ii. 组装
为了更便于调控，同时减小对工程菌的负担，课题组将启动子的四个区域分为了两组。一组 acs A, acs B，组装到 pSB1C3（高拷贝）骨架上，并由 pBAD 启动子调控；一组 acs C，acs D，组装到 pSB3K3（低拷贝）骨架上，并由 pLAC启动子控制。构建结果如下所示。
图1：acs AB 和 acs CD 回路示意图
图2：acs AB 和 acs CD 回路的质粒图谱
c.表征与结果
回路构建好后，先将 acs AB 的回路转化到 DH10β 中，后制备成电转化感受态。随后将 acs CD 的回路利用电转化的方法转入 DH10β 中，如此以来，就获得含有 acs AB 和 acs CD 回路的 DH10β 菌株了。
准备 LB 平板，刚果红终浓度为 20 μM，并添加有 0.1 % 阿拉伯糖、0.5 mM IPTG、50 μg/mL 氯霉素、25 μg/mL 卡那霉素和 1 % 葡萄糖，用来做 DH10β 的 BC 生产的定性表征。此外，课题组也利用刚果红测试了 acs AB 的功能，以此探索单独的 Acs AB 元件是否足以实现纤维素生产。
结果表明，两个回路都在 DH10β 菌株中正常表达，刚果红测试显示阳性结果。
图3：BC表征实验（左：阴性对照-空载体 右：实验对象- DH10β - acs ABCD）
另外，实验结果也表明，缺乏 Acs CD 的菌株无法将 BC 分泌出胞外。这可以从实验数据中看出。BC 无法分泌出胞外，则无刚果红与 BC 结合，其在 490 nm 的吸收峰（游离刚果红的最大吸收峰）也毫无差别。值得一提的是，在这个实验中，课题组还对不同温度下诱导表达 BC 的情况进行了测试。结果表明，低温状态（30℃）下纤维素合酶折叠和发挥功能的情况可能是最佳的，其能产生的 BC 与刚果红结合，使得介质中的刚果红减少，使得 490 nm 处的吸光度降低。从数据中看出，吸光度有降低的情况，这说明，在 30℃ 下，Acs AB 还是右一些活性的，即使大肠杆菌的最佳生长温度是 37℃ 。
图4：Acs AB的功能测试
（从左到右：空载体，未诱导的acs AB回路，诱导的acs AB回路）
图5：30 ℃ 情况下膜组分在 490 nm 下的吸光度
（左：空载体，右：诱导的 Acs AB）
思考
Thought
此课题利用木醋杆菌的基因改良了大肠杆菌，是另一种改良大肠杆菌的方法。虽然我们也用了类似的方法（引入 bcs AB），但目前仍担心仅仅这样还不足以达到很高的产量。我们也考虑过直接使用野生的木醋杆菌，目前希望还寄托在 EcNP 上，希望搭配环二鸟苷酸能有好的结果。后续再就环二鸟苷酸如何应用以及发挥效用继续探究。
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