XMU-iGEM 2024课题分享
1、课题标题
ELIXIO— Toulouse INSA-UPS
2、课题背景
香水在我们的日常生活十分常见。2020年全球香水市场价值达到328亿美元，预计在接下来的几年里香水市场也将稳步增长。香料用于香水，也用于许多其他化妆品和卫生用品。但如今许多调香师和配方师通过化学手段来产生这些香料分子，其生产过程耗能且并不环保。所以该课题组想要通过合成生物学的方法来合成这些香料分子。
课题原理
该课题组开发了一个模块化的平台来产生具有紫罗兰气味的气味分子。为了采用可持续和环境友好的方法，我们设计了一个由酵母(Saccharomyces cerevisiae)和分泌蔗糖的蓝藻(Synechococcus elongatus UTEX 2973 CscB+)组成的合成微生物联合体。酵母经改造后可产生具有花香的紫罗兰萜类化合物：α-离子酮、β-离子酮、二氢β-离子酮和芳樟醇；蓝藻经工程改造后可以产生紫罗兰叶醛：nona-2,6-二烯醛和nona-2,6-二烯醇。每个分子的比例计划由一个调节系统来调节，以产生这些气味分子的定制混合物。
（一）生产紫罗兰萜烯的工程酿酒酵母菌
该课题组需要在酵母中产生四个分子，最重要的是紫罗兰酮和芳樟醇。由于这些分子不会在酿酒酵母中自然产生，该课题组往酵母菌中引入了相关的酶来创造新的合成途径。
图1：在酿酒酵母中生产紫罗兰 α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、二氢-β-紫罗兰酮和芳樟醇萜烯内源和外源通路
1. α-紫罗兰酮和β-紫罗兰酮
紫罗兰酮属于C13 apocarotenoids。在某些植物中，番茄红素分两步产生紫罗兰酮。番茄红素首先转化为胡萝卜素，然后被类胡萝卜素裂解双加氧酶(CCD)裂解，产生两个离子酮分子。α-紫罗兰酮由ε-胡萝卜素裂解产生，β-紫罗兰酮由β-胡萝卜素裂解产生。对于α-紫罗兰酮的生成，该课题组利用了来自 Latuca sativa的lycopene ε-cyclase(LcyE)将番茄红素转化为ε-胡萝卜素，而对于β-紫罗兰酮的生产，该课题组选择了Pantoea ananatis中的lycopene β-cyclase (CrtY)将番茄红素转化为β-胡萝卜素。
由于涉及CCD酶的下一个酶促步骤先前已被证明是限速步骤。为了克服这一限制，对大肠杆菌中最高效的CCD进行了合理的酶工程改造。在这项工作中，从OfCCD1进行定点诱变，分离出催化性能更好的突变体，但仍有很大比例的ε-胡萝卜素和番茄红素未被转化，这可能是由于细胞质OfCCD1酶难以接近其通常被困在膜内的底物。为了解决这个问题，将工程化的OfCCD1融合到膜结合的LcyE中。总的来说，这些修饰使大肠杆菌中的α-离子酮增强了>2.5倍。
2. 二氢-β-Ionones
β-紫罗兰酮在青蒿烯酸还原酶DBR1的催化下可以转化为二氢-β-紫罗兰酮。
3. 芳樟醇
芳樟醇是一种源于GPP的单萜类化合物(C10)。在芳樟醇合成酶(LIS)的作用下，GPP会转化成芳樟醇。该课题组选择了来自Lavandula angustifolia的LIS基因。
4. 改进
由于在α-紫罗兰酮中出现的问题也存在于β-紫罗兰酮中，该课题组选择设计两种融合酶。首先，为了在酿酒葡萄球菌中产生α-紫罗兰酮，我们使用(GGGS)4linker将工程OfCCD1融合到LCYe的c末端，同样的方法也应用于β-紫罗兰酮。在这种情况下，该课题组选择了矮牵牛(PhCCD1)的CCD1，因为它对β-胡萝卜素具有更高的选择性。
除了CrtY和PhCCD1之间的融合酶外，还针对β-ionone进行了另一种设计作为备用方案。为此，分离了CrtY和PhCCD1基因。为了实现底物通道并增加PhCCD1对底物的可及性，这种酶在这种情况下使用fyn目的肽定位到膜上。除了单个氨基酸突变(K164L)外，与酵母中的天然酶相比，该策略已被证明可将β-离子酮的产量提高4倍。
图2，图3，图4：生物酶法合成 α-紫罗兰酮，β紫罗兰酮和紫罗兰的中心香料气味的总括
（二）可持续生产紫罗兰绿香味的工程蓝藻
该课题组希望设计一个合成微生物联盟，由改造的生产萜烯的酵母菌株和已经改造的分泌蔗糖的蓝藻(S. elongatus)组成，后者为酵母菌提供碳源。此外，为了进一步完善生产紫罗兰香的目标，该课题组进一步改造了蓝藻，使其生产紫罗兰叶醛。虽然这些分子在紫罗兰香中是次要的，但可以使其尽可能接近完美的紫罗兰香。
1. 蔗糖分泌，与酿酒酵母共培养：
已知许多蓝藻能积累蔗糖以抵抗渗透胁迫。在iptg诱导启动子PlacUV5的控制下，在蓝藻UTEX 2973中引入了来自大肠杆菌的sucrose/H+ symporter CscB，其产糖率为1.9 g.L−1。
图5：在 Syn UTEX 2973 中蔗糖分泌的途径 （A）
在Syn UTEX 2973 中蔗糖分泌的代谢途径（B）
但如果从培养基中回收糖，该方法既昂贵又低效，另故该课题组选择在分泌蔗糖的蓝藻和酵母菌间建立合成微生物联盟。工程微生物群落在合成生物学应用方面具有巨大的潜力。优势包括增强稳健性，减少劳动分工带来的代谢负担，以及生物之间的资源交换和沟通。该课题组决定在产生萜烯的工程酵母菌株和分泌蔗糖的Syn UTEX 2973菌株之间建立共培养。
蓝藻产生的蔗糖和氧气被酵母利用，酵母在生长过程中产生二氧化碳，为蓝藻模块提供额外的碳源。这样，两种生物以一种互惠互利的方式相互作用，使得二氧化碳为基础的紫罗兰香成分的可持续生产。
图6：ELIXIO，一种用于生产可持续紫罗兰香水合成微生物联盟
2. 紫叶醛通过脂氧合酶途径产生
S. elongatus能够在强光和CO2富集的条件下产生不饱和脂肪酸，如亚油酸或α-亚麻酸(Silva et al. 2014)。这些分子是可以成为“紫罗兰叶醛”的前体:(2E,6Z)-非二烯醛和(2E,6Z)-非二烯醇。这些“绿叶醛”的产生通过脂氧合酶途径在植物中自然发生。在这一途径中，脂肪酸被脂氧合酶(LOX)氧化形成相应的氢过氧化物，其会在氢过氧化物裂解酶(HPL)生成所需的绿叶醛。
项目设计
1. pVIOLETTE：α-紫罗兰酮
α-紫罗兰酮是紫罗兰气味的特征分子，该课题组将关键的LcyE-OfCCD1融合，并使用强半乳糖诱导启动子的对其的表达进行控制。
图7：生产α-紫罗兰酮基因回路
2. pFRAMBOISE：β-紫罗兰酮
由于β-ionone也对紫罗兰气味有重要贡献，故该课题组使用PTetO7对其进行精细的调控，PTetO7由rtTA激活剂控制，响应多西环素的添加。
图8、图9：生产β-紫罗兰酮的基因回路
3. pFLEUR：芳樟醇和二氢-β-紫罗兰酮
该质粒中使用了两种诱导型的启动子进行调控：DBR1表达受雌二醇诱导启动子PZ3eV控制，芳樟醇合成酶表达受铜诱导启动子PCUP1控制。
图10：生产芳樟醇和二氢-β-紫罗兰酮的基因回路
4. pCONCOMBRE：
该质粒的设计基于质粒pAM4951。该质粒可以用于将染色体整合到蓝细菌的中性位点I (NSI)中，这将产生一个具有中等拷贝数插入片段的稳定菌株。此外，该质粒骨架还包含一个大肠杆菌pBR322复制起点以及一个质粒转移的接合起点。
图11：可以用于将染色体整合到蓝细菌的中性位点I (NSI)的基因回路
个人评价
首先在选题上选择了法国香水制造业作为选题背景，指出了现今香水制造的环境问题，在关于香水的环保制造上进行了课题设计，这使得该课题的设计具有较高的现实意义与经济价值。之后在课题设计上相对完整，运用到了两个底盘生物，并采用共培养的方式使得两种菌互惠互利，进而解决以二氧化碳为原料的香水制造。
同时，该课题组的对相关的香水市场进行了调研，使其课题更具备了可行性。此外该课题组在进行人类实践时，进行的调查与采访相对全面，课题的每个部分都与人类实践息息相关，具有较高的现实价值与现实意义。
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