课题阅读
XMU-China 2023
课题：
SSR: Saline-alkaline Soil Restorer
主要内容：
利用谷氨棒状杆菌合成γ-PGA 来改善盐碱地
关键词：
盐碱地、γ-聚谷氨酸、谷氨酸棒状杆菌、土壤恢复
一、背景介绍
在中国，盐碱地已经成为一个日益突出的问题。仅看1998年的数据，我国盐碱地面积已达99万公顷，居世界第三位。同时，由于过度耕作或缺乏保护，曾经正常的土壤也在逐渐变成盐碱地。
图1.中国的盐碱地分布及类型
该团队发现粘性聚合物γ-聚谷氨酸（γ-PGA）可以通过解离产生氢离子，因此可以中和碱并吸收土壤胶体中的可交换钠离子，从而恢复土壤。此外，它还可以形成soil aggregate（良好的土壤结构），提高土壤的持水能力，有利于植物的根系。因此，该团队认为γ-PGA正是需要为这个项目找到的目标产品。
有两种细菌与γ-PGA有关：枯草芽孢杆菌，如果喂食原料谷氨酸，它们可以合成γ-PGA。和谷氨酸棒状杆菌，它本身可以高产合成谷氨酸。
最初，该团队希望设计一个共生系统，其中谷氨酸棒状杆菌可以提供谷氨酸，枯草芽孢杆菌可以产生γ-PGA。然而，在与专家的进一步讨论中，得知这两种细菌在土壤中并不清楚是否为互利共生关系。因此，最终选择了谷氨酸棒状杆菌作为底盘，旨在通过工程单独合成γ-PGA。
二、实验设计
通过对课题整个设计逻辑的逐步了解，该课题的设计思路便十分容易理解，首先既然要赋予谷氨酸棒状杆菌独特的功能，那就应该导入产生γ-PGA的基因，然后确保整个通路连贯使得其最终能够产生γ-PGA，其中该课题组便增加了一步：修改谷氨酸棒状杆菌的TCA循环，使得更多的谷氨酸用于γ-PGA合成，最后便是保证生物安全，防泄露。
第一步，验证所选启动子的强度。在此，该团队选择了一种较为独特的组成型启动子（P0864（BBa_K3796000）），由于在注册表中几乎没有信息，因此该团队打算先来测试其强度。下图为设计的检测启动子强度的基因回路。由于是组成型启动子，因此需要外加一个Ptac启动子来控制起始，而空白组则是用来排除Ptac启动子泄露表达的影响。该实验在谷氨酸棒状杆菌和大肠杆菌中皆进行了实验。
图2.检测P0864强度的遗传回路
图3.空白对照的遗传回路
实验结果分别呈现了定量和定性结果，并可以看出P0864是一种组成型强启动子，同时在谷氨酸棒状杆菌和大肠杆菌皆有效。但是在谷氨酸棒状杆菌中强度更大。
图4.定性观察大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌表达的荧光蛋白的差异
a.离心后谷氨酸棒状杆菌的图像，实验组（左）和对照组（右）。
b.离心后大肠杆菌的图像，实验组（左）和对照组（右）。
图5.大肠杆菌和谷氨酸梭菌在37°C培养26小时后，测定荧光强度数据与OD600数据的比值
（580nm的激发光和610nm的发射光）
第二部分，进行合成γ-PGA的基因导入。
图6.需要构建模块
其中，合成γ-PGA相关基因已经较为明晰，其中涉及capA、capB和 capC三个蛋白的相关基因。然而可惜的是，由于模块长度较大，没能将三个片段整合在一起。
第三部分，增强工程菌用谷氨酸合成γ-PGA的代谢途径。
为了改善由柠檬酸循环中间体α-酮戊二酸形成的谷氨酸的产生，该团队决定衰减编码KGDH的odhA，催化α-KG形成琥珀酰辅酶A形成，从而将更多的碳通量引入谷氨酸合成而不是琥珀酰辅酶A形成。因此，该团队设计了将较弱强度的RBS引入其ORF上游以进行odhA衰减的实验。这涉及了对其基因组进行修饰。
图7. C. glutamicum基因组ppc上游RBS修饰序列
该团队成功构建了重组质粒，并且使用电穿孔的方法将其转化进入谷氨酸棒状杆菌中，但是在最终抗性筛选过程中，没能发现最终的重组型细菌。
第四步，这也是为什么我重点阅读该课题，自杀开关。
由于该课题的着眼环境是盐碱土地，因此该团队希望当工程菌感知到盐碱度下降或PH改变时便启动自杀开关，其中涉及盐碱度感知启动子、PH感知启动子、毒性蛋白三部分。该团队验证的方法也十分有逻辑性，用绿色荧光蛋白分别验证两种启动子的敏感性，然后验证蛋白毒性，最后合在一起来测试效果。
图8.用于PgsiB（盐浓度感知）验证的基因回路
图9. 用于Patp2（PH应激）验证的基因回路
图10. 用于ndoA（毒性蛋白）验证的遗传回路
分开测定，盐浓度感知、PH应激都能产生不同的绿色荧光蛋白的表达，同时毒性蛋白也能在一定浓度下起到杀伤作用。也就说results部分有着符合预期的结果。但是同样可惜的是，该团队并没有完成最终的复合开关的检验。
三、实现形式：
考虑到成本的问题，该团队选择使用直接的菌剂产品进行播撒，并不选择将其进行包封或其它处理。目标用户包括土壤修复行业、林业、农业、个体农民，甚至任何想要种点东西的人。细菌制剂有四种形式，包括冻干粉、粉剂、颗粒剂和液体剂，该团队考虑到在不同的条件下使用它们。
如果用户能负担得起高昂的价格，可以选择冻干粉状菌剂，这种菌剂易于储存，容易渗入土壤。使用时，需要提前将药剂与特殊液体混合。如使用条件为温室或其他无风多尘的地方，用户可通过孔洞或挖沟使用粉状菌剂。粉末的最大优点是储存时间长，易于运输。如果用户需要药剂既要长期储存，又适合多风多尘的地区，可以通过发掘填埋的办法使用颗粒剂。如果用户想要使用少量的产品同时想达到最佳效果，他们可以通过喷灌或滴灌来尝试液体细菌剂。但要注意，买了要马上用，因为液体剂不能长时间储存。
四、个人观点：
通过对其设计及使用思路的梳理，细致地了解到每个实验操作所要验证的部分。先单独针对每个part的有效性进行验证，可以避免前面的不起作用而影响接下来的实验，同时即使出现失败，整个课题的设计脉络也是清晰的。但是可惜的是，该课题受到疫情的影响，多数实验仅停留在results部分，最终的POC部分都没有进行检验，而且在诸如获得改变代谢特征的菌株这一单独的实验中，也没能获得预期的结果。最后，由于是在土壤中的应用，其最终的实现形式可以借鉴。自杀开关由于其课题特性，无法利用到我们自己的课题中。
五、整体思路补充：
谷氨酸棒状杆菌本身能够产生谷氨酸，希望导入外源基因，这些基因所表达的蛋白能够协助γ-PGA（γ-聚谷氨酸）产生，然后确保整个通路连贯使得其最终能够产生γ-PGA。
第一部分，验证所选启动子的强度（因为本次选择了较为特殊的启动子）
第二部分，进行合成γ-PGA的基因导入
第三部分，增强工程菌用谷氨酸合成γ-PGA的代谢途径
第四部分，自杀开关的设计与验证。在这一部分的验证中同样进行了分步验证，最后整体验证。（虽然整体验证没成功）
【竞赛报名/项目咨询请加微信：mollywei007】
