1. 论文基本信息
论文名称：
Hao, W.; Li, K.; Ma, Y.; Li, R.; Xing, R.; Yu, H.; Li, P. Preparation and Antioxidant Activity of Chitosan Dimers with Different Sequences. Mar. Drugs 2021, 19, 366.
主要内容：
作为一种常见的海洋寡糖，壳寡糖（COS）已被证实具有良好的抗氧化活性。其抗氧化效果与聚合度、乙酰化程度及糖链序列密切相关，但具体的构效关系尚不明确。本研究通过分离和酶解法获得四种不同序列的壳二糖，并对全部四种壳二糖的抗氧化活性进行研究。
首次揭示了壳寡糖序列对其抗氧化活性的影响规律：还原端氨基在清除超氧自由基和壳二糖还原能力方面起关键作用；同时发现完全脱乙酰化的壳二糖DD表现出最强的DPPH清除活性；而当壳二糖的氨基被乙酰化后，其在清除羟基自由基方面展现出更优的活性。壳寡糖序列研究为COS研究开辟了新路径，更有利于其作用机制的探究。
DOI号：
https://doi.org/10.3390/md19070366
关键词：
壳寡糖二聚体（二聚壳寡糖），抗氧化活性，分离，生物方法
本次阅读目标：
了解二聚壳寡糖的抗氧化活性，探索我们的二聚壳寡糖产物可能得应用方向。
2. 研究背景
活性氧是生物体内氧分子单电子还原的产物。当活性氧浓度过高时，会对蛋白质、脂质和DNA造成损伤，从而导致机体氧化应激状态失衡[1,2,3]。这种氧化应激是引发和促进多种疾病发生发展的重要因素，包括心血管疾病[4]、帕金森病[5]、动脉粥样硬化[6]、神经退行性病变[7]以及癌症[8]等。抗氧化剂能够清除自由基，延缓多种慢性疾病进程，并抑制脂质过氧化反应。目前最常用的抗氧化剂是酚类化合物，如丁基羟基茴香醚（BHA）、二丁基羟基甲苯（BHT）、叔丁基对苯二酚（TBHQ）和没食子酸丙酯（PG）等。然而，这些抗氧化剂都具有一定的毒性，因此人们更倾向于寻找无毒、高效且天然的抗氧化剂。
近年来，生物多糖因其无毒、易得且具有良好的抗氧化活性而受到广泛关注。壳聚糖是由β-1,4连接的D-葡糖胺（GlcN，D）和N-乙酰-D-葡糖胺（GlcNAc，A）组成的线性多糖（本研究中省略单糖单元间的糖苷键表示，加粗大写字母A代表N-乙酰-D-葡糖胺单元，加粗大写字母D代表D-葡糖胺单元），具有良好的羟基自由基清除能力和亚铁离子螯合特性。壳寡糖（COS）是壳聚糖的寡聚物，同样是一种无毒、高效的新型抗氧化剂。壳聚糖和壳寡糖可通过分子量（MW）或聚合度（DP）、脱乙酰度（DA）、乙酰化模式（PA）及序列特征进行描述[16,17]。相比壳聚糖，壳寡糖具有更小的分子量和更好的水溶性，其抗氧化活性已被广泛研究。前期研究表明，壳寡糖能有效清除DPPH自由基，并保护人胚胎肝细胞免受H2O2诱导的氧化应激损伤[18]；还能有效防护铜离子诱导的人神经细胞氧化应激[19]。体内实验证实，壳寡糖可显著提高大鼠总抗氧化能力和超氧化物歧化酶（SOD）活性，并显著降低炎症大鼠血清中丙二醛（MDA）含量。
此外，壳寡糖（COS）的抗氧化活性与其化学结构密切相关，包括分子量（MW）/聚合度（DP）以及脱乙酰度（DA）等参数[21,22]。Marian等研究发现，聚合度为3-7的壳寡糖比聚合度为3-17和3-24的壳寡糖具有更好的抗氧化活性[21]。本课题组进一步研究了单一聚合度壳寡糖的抗氧化活性，发现低聚合度壳寡糖在清除羟基自由基和还原能力方面优于高聚合度壳寡糖[23]。体内实验同样证实，低聚合度壳寡糖具有更优异的抗氧化活性：聚合度为1-5的壳寡糖能显著提高高密度脂蛋白胆固醇水平，增强脂蛋白脂肪酶、肝脂肪酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性。
特别的是，即使具有相同聚合度和脱乙酰度的壳寡糖，仍可能因糖单元排列顺序不同而存在多种异构体，而这些异构体的分离纯化极具挑战性。因此，壳寡糖结构与抗氧化活性之间的关系在某种程度上仍不明确。最新研究表明，壳寡糖的序列结构对其生物活性具有重要影响[28,29]，但序列差异对壳寡糖抗氧化活性的作用机制目前仍不清楚。
基于低聚合度壳寡糖更优的抗氧化效果，本研究选取四种不同序列的壳二糖进行抗氧化活性研究。首先采用尺寸排阻色谱（SEC）结合酶法脱乙酰化技术制备了三种序列不同的壳二糖（AA/AD/DA），同时通过前期建立的离子交换色谱法获得DD二糖。随后通过体外抗氧化实验系统比较了四种壳二糖的活性差异，从而揭示其构效关系。该研究成果将为开发新型壳寡糖抗氧化剂提供重要理论依据。
3. 实验结果及实验讨论
1. 几丁质寡聚体的制备和表征
壳二糖存在四种可能的序列结构：AA、AD、DA和DD。由于这些序列在天然壳寡糖混合物中难以分离，而化学合成又因涉及多步保护和去保护步骤而耗时费力。本研究采用酶法脱乙酰化策略制备这些壳二糖异构体：首先通过尺寸排阻色谱（SEC）分离N-乙酰化壳寡糖混合物（(GlcNAc)1-6）以获得AA二糖作为后续酶解底物。通过检测210 nm处洗脱液吸光度，我们收集到六个组分（F1-F6）。根据SEC分离原理，这些组分依次对应：几丁六糖（A6）、几丁五糖（A5）、几丁四糖（A4）、几丁三糖（A3）、几丁二糖（AA）及N-乙酰葡糖胺。
选择F5组分进行电喷雾电离质谱（ESI-MS）分析（图2A），其主峰质荷比（m/z）为425.18，与AA的[M+H]+离子峰理论值完全吻合，高效液相色谱检测结果进一步证实F5为纯度达98%的几丁二糖（AA）。所获得的AA二糖可作为酶解底物，用于制备另外两种复杂序列的壳二糖（AD和DA）。
2. 壳聚糖二聚体的两个异源序列的制备和表征
以AA二糖为底物，我们采用两种几丁质脱乙酰酶制备了另外两种壳二糖异构体。其中，NodB脱乙酰酶特异性作用于壳寡糖非还原端的N-乙酰葡糖胺残基[30]，而VcCOD脱乙酰酶则仅对非还原端第二个乙酰基团起作用[31]。通过在大肠杆菌中异源表达这两种酶，并催化AA二糖脱乙酰化反应，成功制备出两种杂化壳二糖。
采用电喷雾电离质谱（ESI-MS）对酶解产物进行分析。结果显示，N-壳二糖与V-壳二糖具有相同的分子量，其主峰m/z 383恰好对应AA二糖失去一个乙酰基（42 Da）后的[M+H]+离子峰。由此可推断AA二糖经酶解后确实发生脱乙酰化反应生成DA或AD二糖，但具体序列结构仍需进一步表征确认。
图1 衍生化V-壳二糖（m/z 577.16）在正离子模式下的ESI-MS/MS谱图。m/z 374.17特征峰对应D-amac片段（源自AD序列还原端产生的Y型离子）
图2 衍生化N-壳二糖（m/z 577.16）在正离子模式下的ESI-MS/MS谱图。m/z 416.18特征峰对应A-amac片段（源自DA序列还原端产生的Y型离子）
3. 壳聚糖二聚体的高效液相色谱分析
在获得全部四种壳二糖后，我们采用亲水作用液相色谱（HILIC）对其纯度进行测定。如表1所示，四种壳二糖的特征参数及对应的HPLC谱图显示：随着乙酰基的逐步脱除，壳二糖与色谱柱的亲和力增强，导致其保留时间相应延长。值得注意的是，DA与AD虽然分子量相同，但保留时间存在显著差异（DA: 8.2 min; AD: 7.6 min），这再次验证了二者为不同序列的异构体。经定量分析，所有四种壳二糖的纯度均达到98%以上，满足后续实验要求。
图3 四种二聚壳寡糖的HPLC光谱
4.COS 对细胞内损伤的影响
代谢过程产生的超氧自由基被认为是“初级”ROS，它可以进一步与其他分子相互作用以产生“次级”ROS 。它可以攻击生物大分子，如脂质、蛋白质、核酸和多不饱和脂肪酸，使它们交叉链或断裂，对细胞造成损害。四种壳聚糖二聚体的清除作用都是浓度依赖性的。AD 的活性优于其他 AD，在 0.5 mg/mL 时清除效果超过 50%，当浓度为 1.5 mg/mL 时达到 75.6%。同时，即使在高浓度下，DA 和 AA 的清除效果也很低。即使浓度超过 1.5 mg/mL，这两种壳聚糖二聚体的清除效果仍低于 15%。四种壳聚糖二聚体的清除效果依次为 AD > DD >> DA、AA，这表明当壳聚糖二聚体的还原端为氨基时，壳聚糖二聚体对超氧自由基的清除作用较好。
图4 四个壳聚糖二聚体的超氧化物自由基的清除作用
还原端的氨基对壳聚糖二聚体的还原能力也至关重要。DD 和 AD 的还原能力随浓度的增加而增加，而 DA 和 AA 的吸光度几乎保持不变。然而，与清除超氧阴离子的能力不同的是，DD 的还原能力比 AD 强。壳聚糖二聚体的还原能力为 DD > AD > > DA、AA 的顺序，这表明还原端的氨基在壳聚糖二聚体的还原能力中也起决定性作用。
图5 四个壳聚糖二聚体的还原力
羟基自由基是氢氧根离子的中性形式。羟基自由基具有高反应性，使其成为一种非常危险的自由基。所有四种壳聚糖二聚体的清除作用也与浓度有关。4 种壳聚糖二聚体的清除作用依次为 AA > DA >> AD、DD。氨基的乙酰化对于清除羟基自由基似乎很重要。DA 在高浓度下的效果明显优于 AD，表明还原端的乙酰基可能使活性更好。
图6 四个壳聚糖二聚体的羟基自由基的清除效应
DPPH 也是评价体外抗氧化作为稳定有机自由基的常用指标。然而，我们发现壳聚糖二聚体不能清除低浓度的 DPPH，除了 DD。AA、AD 和 DA 的清除效果仍然相对较低，尽管它们的浓度已达到 4 mg/mL，并且低浓度和高浓度之间看不到差异。DD 的清除效果在我们的设定浓度内是浓度依赖性的，并显示出良好的 DPPH 清除效果。DD 的清除效果在 4 mg/mL 时可达 64%。
图7 四个壳聚糖二聚体的DPPH的清除效果
我们研究了它们的抗氧化活性，并期望揭示序列对抗氧化活性的影响并阐明结构-活性关系。我们的结果表明，壳聚糖二聚体中的氨基对于清除几种自由基很重要。例如，壳聚糖二聚体 DD 表现出 DPPH 的高清除作用。其他三种壳聚糖二聚体的活性不是很好，但 DA 和 AD 仍然优于 AA。这意味着壳聚糖二聚体对 DPPH 的清除作用主要基于它们的氨基。当二糖中没有游离氨基时，即使在高浓度下，也几乎没有清除 DPPH 的活性。至于 DA 和 AD，由于 DPPH 的空间位阻很大，可能难以接近氨基。以前的研究还表明，COS 中的游离氨基在清除自由基方面起着重要作用，这与我们的结果一致。
除此之外，我们首先证明不仅氨基的存在对于清除自由基非常重要，而且氨基的位置（即序列）也起着至关重要的作用。例如，还原端氨基为（DD 和 AD）的壳聚糖二聚体有利于清除超氧自由基并增强壳聚糖二聚体的还原能力。另一方面，壳聚糖二聚体清除羟基自由基的能力显示出不同的趋势。对于羟基自由基，DA 在高浓度下的效果明显优于 AD，表明还原端的乙酰基使活性更好。此外，四种壳聚糖二聚体的清除羟基自由基效应在 AA > DA >> AD 和 DD 的顺序是高浓度的。氨基的乙酰化似乎对于清除羟基自由基很重要，这与之前关于不同乙酰化程度的 COS 抗氧化活性的报道一致。同时，四种壳聚糖二聚体在清除羟基自由基方面的差异实际上是这些指标中最小的，这也表明该序列对清除羟基自由基的作用最小。
5. 结论
在这项研究中，我们分离了几丁质二聚体 （AA），并以 AA 为底物，通过酶解进一步制备了另外两种壳聚糖二聚体 （DA 和 AD）。研究了壳聚糖二聚体的 4 个不同序列的抗氧化活性。最后，我们发现 COS 的抗氧化活性不仅取决于其 DP 和 DA，还取决于其序列。一般来说，DD 具有更好的清除超氧自由基和 DPPH 的能力，也表现出更好的还原能力。
此外，壳聚糖二聚体清除不同自由基的效果也不同。这可能与它们的机制有关。这些结果表明，短链 COS 具有很强的抗氧化活性，短链 COS 具有处理氧化应激相关疾病的潜在能力，有望发展成为一种天然抗氧化剂。
6. 个人总结
根据本篇文献，壳寡糖二聚体有很强的抗氧化能力。因此可以考虑作为抗氧化剂应用在多个领域。例如：
1. 食品与饮料：食品防腐剂，功能性食品
2. 医药与保健品：抗衰老与抗炎药物，心血管保护，神经保护
3. 化妆品与护肤品：抗衰老护肤品，美白产品，防晒产品
4. 农业与动物饲料：植物保鲜，动物饲料
5. 材料科学与工业：塑料与橡胶，润滑油与燃油，纺织品
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